統合されたマイクロバイオーム - 長沙ダヴウィンググループ

Scientific Data volume 10、記事番号: 280 (2023) この記事を引用

436 アクセス

9 オルトメトリック

メトリクスの詳細

過剰な脂肪の蓄積は代謝性疾患を引き起こす可能性があり、脂肪の蓄積と代謝性疾患との関係を断ち切る要因を特定することが重要です。健康な肥満の莱蕪豚（LW）は脂肪含有量が高いですが、代謝性疾患には耐性があります。この研究では、LW豚とルーライ豚（LU）の糞便マイクロバイオーム、糞便と血液のメタボローム、ゲノムを比較し、脂肪沈着と代謝性疾患との関連をブロックする可能性のある要因を特定しました。私たちの結果は、炭水化物代謝に関与するスピロヘータとトレポネーマにおいて、LW と LU の間で大きな違いがあることを示しています。糞便と血液のメタボローム組成は類似しており、血液代謝物の一部の抗代謝疾患成分は 2 つの品種の豚間で異なりました。予測された差次的 RNA は主に脂質代謝とグルコース代謝に富みており、これは示差的な微生物叢と代謝産物の機能と一致しています。下方制御された遺伝子 RGP1 は、トレポネーマと強い負の相関があります。私たちのオミクスデータは、ヒトとブタの両方の健康な肥満に関するさらなる科学研究に貴重なリソースを提供するでしょう。

過剰な脂肪の蓄積は、臓器への慢性的な損傷や代謝性疾患につながる可能性があります1、2、3。しかし、遺伝的要因だけではこれらの症状を完全に説明することはできません4。腸内微生物叢や代謝物 5,6,7,8 などの代謝因子の役割は、肥満誘発性の慢性代謝性疾患の原因を理解する上でますます注目を集めています 9,10,11。腸内微生物叢の組成の変化は、高血圧、アテローム性動脈硬化、2 型糖尿病 (T2DM) などの慢性代謝疾患を引き起こすことが示されています 12、13、14。微生物叢は、トリメチルアミン N-オキシド (TMAO) などの必須代謝産物を生成し、アテローム性動脈硬化症、T2DM、心血管疾患 (CVD)、脳卒中などの慢性代謝疾患と直接関連しています 15、16、17、18。さらに、腸内微生物叢は、未吸収/未消化の炭水化物を発酵させて、短鎖脂肪酸 (SCFA) などの脂肪族有機酸を生成することができます 19,20。 SCFA は、G タンパク質共役受容体を通じて食事誘発性の肥満から宿主を保護することができ、微生物叢は SCFA を通じて間接的に宿主の脂質代謝を調節します 21、22、23。したがって、腸内微生物は内分泌器官として機能し、宿主の生理機能に影響を与える生理活性代謝産物を生成します7、24、25、26。逆に、最近の研究では、腸内細菌叢を変化させることによって宿主ゲノムが関連する表現型に影響を与える可能性があることが示されています。たとえば、ABO 遺伝子型は、N-アセチルガラクトサミン (GalNAc) を制御することによって腸内微生物叢の構造に影響を与える可能性があります 27。したがって、オミクス解析を統合することは、個人を代謝性疾患から守る重要な要素を特定するのに役立つ可能性があります。

ブタは、脂肪、フルクトース、炭水化物を多く含む餌を与えられているため、非アルコール性脂肪肝疾患 (NAFLD)、T2DM、CVD などの代謝性疾患に耐性がある傾向があります 28,29。この現象は、肥満であるが代謝性疾患を予防している代謝性健康肥満 (MHO) に似ています 30。中国の莱蕪豚（LW）は、皮下脂肪や筋肉内脂肪（IMF）などの脂肪含有量が高いことで知られています31、32、33、34。特にLWのIMFは7％以上に達し、平均は11.6％に達し、最も高い個人は21％に達した。 LW は、50% の LW 遺伝子浸潤を持つルーライ豚 (LU) を育種するために西洋の商用豚ヨークシャー豚 (YS) と交配されました 35。 LU の脂肪含量は LW よりも低く、IMF は約 5%でした。この研究では、2 年間にわたる集中管理のために、同様の食事、衛生状態、環境条件を持つ 8 頭の LW 豚と 8 頭の LU 豚を選択しました (表 1)。私たちは、対象ブタの糞便マイクロバイオーム、糞便メタボローム、血液メタボローム、全ゲノム（図1参照）を処理し、オミクス統合解析を通じて個体を代謝性疾患から守る重要な因子を特定しました。

マイクロバイオーム、メタボローム、ゲノムのオミクスサンプル収集、サンプル処理、データ処理のワークフローの概略図。

結論として、私たちの研究は、LW および LU ブタからの糞便メタゲノム、糞便メタボローム、血液メタボローム、および全ゲノム配列の高品質のデータセットを生成しました。糞便メタゲノムからは、34.5 ギガバイト (Gb) と 35 Gb の組み立てられていない生の読み取りが生成され、炭水化物代謝に関与するスピロヘータとトレポネーマの存在量に大きな違いがあることが明らかになりました。我々は、糞便メタボロームから合計 1,220 個の代謝物、血液メタボロームから 713 個の代謝物を同定しました。どちらも中鎖脂肪酸と長鎖脂肪酸が豊富でした。血液メタボロームには、ヒドロキシ脂肪酸、タンシノン IIA、ベタインなどの抗代謝疾患成分が含まれていました。全ゲノムでは、18 常染色体から平均 21.9 Gb のペアエンドリード、総数 2,350 万の一塩基多型 (SNP) が得られました。 SNP の Fst 解析 (固定指数、ライトの F 統計) により、胆汁分泌と脂肪消化吸収を含む 4 つの KEGG (遺伝子とゲノムの百科事典) 経路が特定され、これらの経路は Fst の上位 1% に豊富に含まれていました。 16 頭のブタの脂肪組織の RNA 発現解析により、412 個の差次的に発現する遺伝子が同定され、これらはデンプンおよびスクロースの代謝およびグリセロリン脂質の代謝を含む 9 つの KEGG 経路に豊富に含まれていました。差次的遺伝子の機能的注釈は、脂質およびグルコース代謝が主に豊富な機能であり、差次的微生物叢および代謝産物の機能と一致していることを示した。さらに、下方制御された遺伝子 RGP1 はトレポネーマと強い負の相関があることが判明し、RGP1 の発現がトレポネーマ存在量の変化と密接に関連していることが示されました。要約すると、私たちの研究は、代謝性疾患の発症における腸内微生物叢、代謝産物、および宿主遺伝学の役割についての新たな洞察を提供します。微生物学的データ、メタボロームデータ、ゲノムデータの統合による抗肥満または抗代謝疾患因子の同定は、これらの疾患の新しい治療戦略の開発につながる可能性があります。

私たちの実験は、LW とヨークシャーの品種を交配した 8 頭の雌の莱蕪豚 (LW) と 8 頭の雌のルーライ豚 (LU) を比較するように設計されました。すべての豚は、中国吉林省のJing-Qi-Shen養豚場で、均一な飼育および給餌条件下で約2年間（715±33日、表1）生まれ、飼育されました。温度、湿度、光は自然の気候条件によって異なります。異なる母親からの子豚が使用され、同腹子ごとに 1 頭の子豚がランダムに選ばれました。子豚の年齢は似ており、実験の中で最も古い豚と最も若い豚は66日離れていた。哺乳期間中、子豚は母親と一緒に過ごし、その後、自動給餌器を備えた豚舎に移されました。子豚には交尾前に3回、妊娠後は朝と夕方に1回、1日5回餌を与えた。雌豚は性的に成熟すると、通常の性的交配と出産に参加しました。サンプル採取時には雌豚は妊娠していなかった。

豚の糞の時間は不規則で、サンプル収集は午前 10 時から午後 5 時までの範囲で行われました。糞便と血液サンプルのサンプリングが行われました。糞便サンプルを汚染から守るため、私たちは清潔な使い捨ての滅菌手袋を着用し、豚の糞尿が地面に触れる前に捕集します。新鮮な糞便サンプルは、準備され、細菌 DNA 保護剤が事前に充填されたサンプル収集チューブに直ちに保存されました。次いで、糞便サンプルを液体窒素中に入れて急速冷却した。各ブタから 2 つの糞便サンプルのチューブが収集され、1 つはマイクロバイオームプロファイリング用、もう 1 つはメタボロームプロファイリング用でした。同じグループのブタは、血液サンプル採取前に 14 時間の一晩絶食を受けました。注射器を使用して各ブタの頸静脈から５ミリリットルの血液を採取した。新鮮な血液を血液凝固促進剤チューブに保存し、室温で 1 時間放置しました。次に、血液混合物を 3,000 g、4 °C で 10 分間遠心分離しました。血液の上部血清を清潔な 1.5 mL チューブに移しました。すべての糞便と血液のサンプルにはラベルが付けられ、さらなる処理のためにドライアイスとともに研究室に輸送されました。

メーカーの指示に従って、EZNAsoil DNA 単離キット (OMEGA、米国ジョージア州ノークロス) を使用して微生物叢 DNA を抽出しました。光学密度 (OD) 1.8 ～ 2.0 での吸光度および 1% アガロースゲル電気泳動を使用して DNA の完全性と DNA の品質を評価し、サンプル DNA はこれらの基準を満たしました。 Covaris M220 システム (Qsonica, USA) を使用して、全 DNA 配列を短い断片に切断しました。 TruSeq™ DNA サンプル調製キット (Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して、300 bp フラグメントをペアエンド (PE) ライブラリーに構築しました。 PE ライブラリーは、Truseq PE クラスターキット v3-cBot-HS (Illumina、サンディエゴ、カリフォルニア州) を使用して評価し、ライブラリー断片の増幅はポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) を使用して実行されました。 Illumina NovaSeq の次世代シーケンス (NGS) には 1.5 μg のサンプルを使用しました。 6000系プラットフォーム。

出力 NGS シーケンスデータは fastq 形式で保存されました。 Trimmomatic36 (v0.39) を使用して生データの品質管理をチェックし、次の基準を使用して処理しました: (a) 平均質量値が設定 50 bp スライディングウィンドウ内で 20 未満の場合、不適合品質リードの末尾は放棄された; (b)、2 つの未知のヌクレオチド (N でマーク) を含む配列は放棄されました。 (c)、アダプターの汚染のある配列は除外されました。 (d)、50 bp 未満の配列長および 20 未満のテールマス値は除外されました。トリミング後、高品質のシーケンスが残りました。宿主ゲノムから得られた配列を除外するために、残りの配列をブタ DNA 参照ゲノム (Sscrofa 11.1) にマッピングし、Burrows-Wheeler Aligner37 (v0.7.17) を使用して類似性の高いリードを除去しました。残りの配列は、Megahit38 (v1.1.1) を使用してコンティグに新たに組み立てられました。最後に、組み立てるコンティグには、MetaGeneMark39 (v3.25) を使用して予測されたオープンリーディングフレーム (ORF) がありました。配列は、95% の一貫性と 90% のカバレッジに設定されたパラメーターを使用して CD-HIT40 を使用してクラスター化されました。各クラスターの最長配列を選択して、重複のない遺伝子カタログを構築しました。次に、SOAPaligner41 を使用して、上記の残りの高品質配列を非重複遺伝子カタログ (同一性 95% に設定) と比較し、特定の遺伝子セットと遺伝子存在量を取得しました。 BLAST (v2.2.28) を使用して遺伝子セットを非冗長タンパク質配列データベース (NR データベース) と比較し、分類学的注釈と存在量を取得しました (アライメントパラメーターの e 値は 1e-5 に設定されました)。最後に、界、門、綱、目、科、属、種の 6 つの分類レベルの分類学的存在量が分析されました。

糞便と血液のサンプルは別々に抽出され、分析されました。サンプル処理の前に、LW サンプルと LU サンプルを等量混合した 3 つの品質管理 (QC) サンプルを事前に準備しました。次に、LW、LU、および QC サンプルを、100 μl の予冷した水および 800 μl の予冷したメタノール/アセトニトリル (1:1、v/v) と混合することによって 100 μl に分離しました。混合物を氷浴上に置き、60分間超音波を照射した。タンパク質を沈殿させるために、混合物を-20℃の冷蔵庫に移し、1時間インキュベートしました。上清を清潔な滅菌チューブに移し、16,000 g、4℃で20分間遠心分離しました。次に、高速真空濃縮遠心分離機を使用して上清を乾燥させました。乾燥粉末を、100μLのアセトニトリル/水溶液(1:1、v/v)を添加することによって再懸濁し、この溶液を16,000g、4℃で15分間遠心分離した。

クロマトグラフィー分離は、四重極飛行時間型質量分析計 (AB Sciex Triple TOF 5600) および HILIC カラム (Agilent 1290 infinity) を備えた Agilent 1290 Infinity LC 超高速液体クロマトグラフィー (UHPLC) プラットフォームによって実行されました。システムの安定性とデータの信頼性を評価するために使用される QC サンプルがサンプルキューに挿入されました。カラム温度は 25 °C、流速は 0.3 mL/min でした。 2 つの移動相があり、相 A には水、25 mM 酢酸アンモニウム、および 25 mM アンモニア水が含まれ、相 B にはアセトニトリルのみが含まれていました。移動相システムの実行手順は次のように設定されました。0 ～ 0.5 分で 95% B。 0.5 ～ 7 分で B の 95% ～ 65%。 7 ～ 9 分で B の 65% ～ 40%。 40% B を 9 ～ 10 分間維持。 10 ～ 11.1 分で B の 40% ～ 95%。 11.1 ～ 16 分で 95% B が維持されました。

コンポーネントの正または負のイオンモードは、エレクトロスプレーイオン化 (ESI) を使用して検出されました。 ESI ソース条件は次のように設定されました。イオンソースガス 1 (Gas1)、60 psi。イオンソースガス 2 (Gas2)、60 psi。カーテンガス (CUR)、30 psi; ソース温度、600 °C。イオンパリティ電圧フローティング (ISVF)、±5500 V。 TOF MS スキャン m/z 範囲、60 ～ 1200 Da。プロダクトイオンスキャン m/z 範囲、25 ～ 1200 Da。 TOF MS スキャン蓄積時間、0.15 秒/スペクトル。プロダクトイオンスキャン蓄積時間、0.03 秒/スペクトル。二次質量分析は、情報依存取得 (IDA) を使用して取得され、高感度モード、デクラスタリング電位 (DP)、±60 V で使用されました。衝突エネルギー、30 eV。 IDA は次のように設定されました: 4 Da 以内の同位体を除外します。サイクルごとに監視する候補イオン、6.

生の質量分析 (MS) データは、ProteoWizard によって mzXML ファイルに変換されました。 MSDIAL ソフトウェアのプログラム XCMS を、ピークのアライメント、保持時間の補正、およびピーク領域の抽出に使用しました。抽出されたデータについては、グループ内の欠損値が 50% を超えるイオンピークを削除しました。次に、正イオンと負イオンのピークを統合し、ソフトウェア SIMCA-P 14.1 (Umetrics、スウェーデン、ウメア) をパターン認識に使用しました。代謝物構造の同定には正確な質量マッチング (<25 ppm) と二次スペクトルマッチングが使用され、ヒトメタボロームデータベース (HMDB) やマスバンクデータベースなどのデータベースが検索されました。代謝物を取得した後、MSDIAL 検索ソフトウェアを使用して代謝物を分類しました。データは、その後の分析のためにパレートスケーリングによって正規化されました。

血液ＤＮＡ抽出は、ＴｒｕＳｅｑＤＮＡＬＴサンプルプレップキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）プロトコールに従って実施した。 DNA の品質は、NanoDrop 2000 分光光度計 (Thermo Fischer Scientific、米国) を使用して OD 1.6 ～ 1.8 での吸光度を測定することによって評価し、DNA の完全性は 1% アガロースゲル電気泳動によって確認しました。続いて、Covaris M220 を使用して DNA 配列を 350 ～ 450 bp の断片に断片化しました。フラグメントの末端を修復およびリン酸化し、続いて NextFlexTM Rapid DNA-Seq Kit (Bioo Scientific, USA) を使用してアダプターを接続しました。最後に、ライブラリを 15 サイクルの PCR で増幅して小さな断片を濃縮しました。ライブラリの品質と濃度は Qubit (Thermo Fischer Scientific、米国) を使用して決定され、PE150 シーケンスは Illumina NovaSeq で実行されました。 6000系プラットフォーム。

シーケンスデータはfastq形式で保存されました。 Fastp42 (v0.20.0) をデフォルトのパラメーターとともに使用して、読み取り、フィルター処理、および読み取りの品質のプロファイリングを行いました。 BWA37 (v0.7.17) を使用して、高品質のリードをブタ参照ゲノム (Sscrofa11.1) にマッピングしました。 SAM ファイルは SamTools43 (v1.10) によって BAM ファイルに変換されました。重複したリードは Sambaba44 (v0.7.1) を使用して削除されました。データカバレッジと深度は、Mos Depth45 (v0.2.9) を使用して計算されました。 GATK46 (v4.1.6) ハプロタイプコールを使用して各サンプルを処理し、中間 GVCF を生成しました。これは、遺伝子型 GVCF 内のすべてのサンプルの共同遺伝子型解析に使用されました。最後に、SNP は次の基準に基づいてフィルタリングされました：（1）QD < 2.0、FS > 60.0、MQ < 40.0、MQRankSum < -12.5、ReadPosRankSum < -8.0、SOR > 3.0。 (2) マイナー対立遺伝子頻度 (MAF) < 0.01。 (3) GATK バリアントのコール率 < 0.9。得られた SNP の数を表 4 に示します。遺伝子型密度分布は、CMplot R パッケージを使用してマッピングしました。主成分分析 (PCA) は、Plink47 (v1.9) を使用して計算されました。集団の遺伝構造解析は、Admixture48 (v1.3.0) を使用して実行されました。ヨークシャー豚 (YS)、デュロック豚 (DU)、およびランドレース豚 (LR) の SNP を含む PCA および混合物分析は、PHARP データベース 49 (http://alphaindex.zju.edu.cn/PHARP/index.php) から取得されました。。 FST 分析は、VCFtools50 (v0.1.13、-fst-window-size 50,000-fst-window-step 10,000。ウィンドウサイズ 50 K、ステップサイズ 10 K) を使用して実行されました。遺伝子発現予測は、FarmGTEx TWAS サーバー 51,52 (http://twas.farmgtex.org/) を使用して実行されました。遺伝子オントロジー (GO) および KEGG の機能アノテーションは、http://kobas.cbi.pku.edu.cn/ を使用して実行されました。

糞便メタゲノムは、LW サンプルと LU サンプルからそれぞれ 34.5 Gb と 35 Gb の組み立てられていない生のリードを生成しました。品質管理後、配列 Q20 比率 (総塩基数に対する質量値 20 の塩基の割合) は 96.99% を超え、Q30 比率は 91.67% を超え、データ品質がさらなる分析に適していることを示しました。平均して、LW データセットからは 550 万件、LU データセットからは 570 万件のクリーンリードが得られました (表 2)。 2 つのブタ品種間の配列のグループ間多様性は、シャノンおよびシンプソン多様性指数を使用して計算されました。全体の配列には顕著な差はありませんでした (図 2C、D)。 LU グループには LW 遺伝子の 50% が浸潤され、約 2 年間一貫した環境で維持されました。これが、2 つのグループのブタの無差別な微生物組成の原因となっている可能性があります。クリーンリードをコンティグにアセンブルし、95% の類似性と 90% のカバー率に基づいてクラスター化して、平均長 622 塩基対の合計 420 万個の ORF からなる非重複遺伝子カタログを生成しました。遺伝子アノテーションにより、262,645 個の遺伝子が LU に固有であり、350,102 個の遺伝子が LW に固有であることが明らかになりました (図 2A)。 LU は LW よりも多くの配列とコンティグを持っているにもかかわらず、注釈付き遺伝子の数が少なくなっていました。肥満個体では遺伝子数が低く、細菌の多様性が低いというこれまでの報告53、54、55とは対照的に、我々の結果は、肥満の豚ほど遺伝子数が多く、これまでの知見に反していることを示している。 2 つのブタ品種からの遺伝子存在量の累積頻度統計では、ほとんどの間隔で有意な差は示されませんでしたが、カウントが 40 近くある遺伝子は、LU よりも LW で有意に豊富でした (図 2B)。この発見は、2 つの品種のブタが異なる組成を持ち、主にこの間隔に位置していることを示しています。

LW と LU 間の微生物遺伝子統計と多様性の比較。 (A) 遺伝子統計。 (B) 遺伝子の累積頻度統計。 (C) シャノン多様性指数。 (D)。シンプソンの多様性指数。

LW と LU の微生物環境が非常に類似しているのは、高度な遺伝子浸潤と飼育環境に起因すると考えられます。しかし、残りの異なる微生物が脂肪の沈着に関与している可能性があり、これが 2 つの豚品種の脂肪含有量の違いにつながります。したがって、LW と LU の間の微生物の違いを特定するためにさらなる分析を実施しました。私たちは、門、綱、目、科、属、種を含む 6 つの分類学的分類レベルでマイクロバイオームを要約しました。 LW では、合計 146 門、90 綱、323 目、304 科、2,691 属、14,570 種が検出されました (表 3)。一方、LU は 145 門、90 綱、321 目、306 科、2,651 属、14,324 種を示しました (表 3)。階級および家族レベルでの分類学的注釈が不明であるため、統計はより低くなりました。門分類レベルでは、ファーミクテス属 (66.94%)、バクテロイデス属 (17.93%)、およびプロテオバクテリア属 (5.69%) が主要な門であり、放線菌属 (2.38%)、スピロヘータ属 (1.46%)、線維菌属 (0.62%)、およびプランクトミセス属 ( 0.5％）もかなりの量で存在します（図3A、補足表S5）。ファーミクテス属、バクテロイデス属、およびプロテオバクテリアの合計割合は 91% に達し、その割合がトレードオフになったため、ニッチ競争が最も強くなりました (補足表 S1)。属分類レベルでは、主な属はクロストリジウム属 (6.55%)、バクテロイデス属 (4.93%)、プレボテラ属 (7.15%)、連鎖球菌属 (4.2%)、オシリバクター属 (4.05%)、ルミノコッカス属 (3.39%)、フェカリバクテリウム属 (1.8%) でした。）、ユーバクテリウム（1.8％）（図3B、補足表S2）。我々は、LWとLUの門と属の分類レベル間の差異を分析するためにウィルコクソン順位和検定を実施しました。その結果、門分類レベルでの LW と LU の間のスピロヘータの存在量に有意な差があることが明らかになりました (図 4A)。スピロヘータは炭水化物の代謝プロセスに関与していることが報告されています56、57、58、59。属の分類レベルでは、LW と LU の間でトレポネーマの存在量に有意な差がありました (図 4B)。トレポネーマはスピロヘータに属する属です。

LW および LU における豊富な微生物叢の構成。 (A) 門の分類レベル。 (B) 属分類レベル。

LW と LU における門および属の分類レベルでの異なる微生物叢。 (A) 門の分類レベル。 (B) 属分類レベル。

品質管理 (QC) サンプルの総イオンフローパターン (TIC) を、正イオン検出モードと負イオン検出モードで比較しました。各クロマトグラフィーピークの応答強度と保持時間が重なっており、機器誤差による変動が最小限であり、データ品質が信頼できることを示しています。糞便メタボロームについては、12,226 個の正イオンピークと 6,891 個の負イオンピークを抽出し、そのうち 703 個の正イオンピークと 517 個の負イオンピークに注釈が付けられました。注釈付きの1,220の代謝物は、トリテルペノイド、長鎖脂肪酸、キサントフィルを含む453のクラスに分類され、それぞれ53、19、13種類の代謝物がありました（図5A、補足表S3）。血液メタボロームでは、5,977 個の正イオンピークと 3,081 個の負イオンピークが検出され、そのうち 368 個の正イオンピークと 345 個の負イオンピークに注釈が付けられました。注釈付きの713個の代謝物は、トリテルペノイド、アコニタン型ジテルペノイドアルカロイド、アルファアミノ酸を含む360のクラスに分類され、それぞれ15、14、11個の代謝物がありました（図5B、補足表S4）。長鎖脂肪酸と中鎖脂肪酸が、糞便と血液の両方のメタボロームにおいて主要な脂肪酸であったことは注目に値します。これらの脂肪酸は容易に酸化および加水分解され、血中脂質とコレステロールを低下させることができ、これが豚の肥満関連代謝性疾患に対する感受性の低下に関係している可能性があります。糞便メタボロームの組成は血液メタボロームの組成と類似しており、トリテルペノイド、キサントフィル、長鎖脂肪酸、中鎖脂肪酸、脂質、αアミノ酸を含んでいます（図5A、B）。 2 つのメタボロームの主要な代謝産物の組成は非常に類似しており、それらの物質の一部は関連している可能性があります。

糞便および血液のメタボローム代謝産物の分類。 (A) 糞便メタボロームの代謝産物。 (B) 血液メタボロームの代謝産物。代謝物成分の数が多い順にランク付けされます。数値はクラスごとの代謝物の数を示します。

血液代謝物は生理学的健康の調節において重要な役割を果たしており、その影響を理解することで、豚が代謝性疾患からどのように保護されているかについての洞察が得られます。これを調査するために、血液メタボロームを解析し、OPLS-DAモデルを通じて得られる投影の変数重要度(VIP)を用いて代謝産物の発現パターンの影響強度と説明能力を測定しました。有意差のある代謝物を特定するために、VIP >1 および Pvalue < 0.05 (複数グループ比較のための一元配置分散分析) を持つ代謝物を選択しました。我々の結果により、2つのブタグループ間で有意に異なる81の代謝物が明らかになりました（補足表S5）。これらのうち、アンジェリシン、セキュリニン、ヒポキサンチン、ベタイン、シチジン、ホモシステイン、クルジオン、イノシン、イソピピネリン、5-メトキシソラレン、パルミトイルカルニチン、クエン酸塩、ステアリン酸、シタラビン、リコカルコンA、N-アセチルノイラミンを含む41の代謝物がLWに豊富に含まれていました。酸。一方、ニトラゼパム、アセトアミノフェン、イコサン酸、ガバペンチン、スペガトリン、ジュアレジン酸、デヒドロエフソル、ゴミシン H、DL-2-ヒドロキシ吉草酸など、40 種類の代謝物が LU に多く含まれていました。注目すべきことに、これらの変化する血液代謝産物の一部は、抗脂肪生成および抗慢性代謝性疾患効果があることが示されているため、豚の脂肪含有量に関連している可能性があります。例えば、ヒドロキシ脂肪酸は抗糖尿病および抗炎症効果を示すことが報告されており 60、タンシノン IIA は心血管疾患の治療に使用され、抗脂肪生成効果を持っています 61,62,63。ベタインには抗脂肪肝作用と抗炎症作用があり、高血糖を予防し、インスリン抵抗性を低下させることができます64,65,66。

LW サンプルと LU サンプルでは、それぞれ平均 22 Gb と 21.9 Gb のペアエンドリードが得られ、品質管理後にそこから 1 億 4,460 万と 1 億 4,350 万のクリーンリードが得られました。ゲノムデータの品質は高く、すべての配列の Q20 比率が 95.69% 以上、Q30 比率が 89.27% 以上でした (補足表 S6)。平均ゲノム配列決定深度は 6.8 倍で、カバー率は 97% に達し、アセンブリ、SNP コール、および SNP フィルタリング後に 18 常染色体から合計 2,270 万個の SNP (マイナー対立遺伝子頻度 ≥ 0.05) が得られました (表 4)。 1 メガバイト (Mb) の重複しないウィンドウ内の高密度のヌクレオチド多様性は、すべてのゲノムをカバーします (図 6)。 PCAと混合物の分析により、LWとLUの血統に明らかな違いが明らかになり、LWとLUの豚品種はヨークシャー豚品種とよく区別されます（図7A、B）。さらに、Fst メソッドを使用して、LW と LU の間の選択シグネチャを検出しました。 Fst ピーク値は最大 0.8 であり、グループの区別が比較的高いことを意味します (図 7C)。上位 1% の Fst には 811 個の遺伝子に注釈を付けることができます (補足表 S7)。これらの遺伝子には機能強化によって注釈が付けられ、胆汁分泌と脂肪の消化と吸収を含む6つのGO経路と4つのKEGG経路が得られました（補足表S10）。 FarmGTEx TWAS サーバーを使用した RNA 発現分析により、LW および LU の個々の脂肪組織に合計 2,930 個の遺伝子が予測され、そのうち 146 個が上方制御され、266 個が下方制御されました (補足表 S8)。異なる遺伝子機能に注釈が付けられ、デンプンとスクロースの代謝およびグリセロリン脂質の代謝を含む6つのGO経路と9つのKEGG経路が得られました（補足表S10）。さらに、スピアマン相関分析により、2つの上方制御された遺伝子（ENSSSCG00000025565およびENSSSCG00000049578）と1つの下方制御された遺伝子RGP1（| Cor | > 0.6、Pvalue < 0.05、補足表S9）を含む、属の分類レベルで差次的微生物叢トレポネーマと強く関連する42の遺伝子が同定されました。。

染色体上の SNP の分布。 x 軸は染色体の位置 (Mb 単位) を示し、y 軸は染色体を表します。異なる色は、各 1 Mb ゲノムブロック内の SNP の数に対応します。

LW と LU の間の血統とグループの区別。 (A) LW、LU、YS、LR、DU 豚品種の主成分分析結果。青、オレンジ、赤、紫、緑のマーカーはそれぞれ LW、LU、YS、LR、DU の豚を表します。 (B) K = 2 での祖先数を仮定した場合の祖先構成の結果。K は、可能な祖先品種の数を表す調整可能なパラメーターです。相互検証誤差の計算により、最良の K 値として K = 2 が得られました。 (C) LW と LU の Fst に基づくマンハッタンプロット。

この研究では、糞便メタゲノム、糞便メタボローム、血液メタボローム、全ゲノムの 4 つの異なるデータセットを提示します。メタゲノムとゲノムの生データは、NCBI Sequence Read Archive に fastq 形式で保存されます。予備的な品質管理と統計分析を実施しました。分類学的比率を含む補足表が提供されます。

メタゲノム配列データの生の fastq ファイルは、NCBI SRA データベースの BioProject PRJNA74789367 (補足表 S11 の NCBI Accession 列) で、プロジェクトタイトル「莱蕪豚およびルーライ豚のメタゲノムデータ」で入手できます。全ゲノム配列決定 (WGS) データの生の fastq ファイルは、BioProject PRJNA74911568 (補足表 S12 の NCBI Accession 列) の下の NCBI SRA データベースでも、プロジェクトタイトル「LW および LL の全ゲノム配列決定データ」で入手できます。

糞便メタボロームおよび血液メタボロームデータの生ファイルは、研究固有の識別子 MTBLS39776970 で MetaboLights データベース 69 に保存されます。プロジェクトのタイトルは「中国の莱蕪豚とルーライ豚の統合されたマイクロバイオーム・メタボローム・ゲノム軸データ」です。

学者によるより迅速な再利用を促進するために、複数のオミクスからの生データの品質管理と予備分析を実施しました。予備的な統計データは補足情報からアクセスできます。同時に、Excel 版の添付ファイルが http://alphaindex.zju.edu.cn/ALPHADB/download.html にアップロードされました。補足情報には次のものが含まれます。

表 S1: 各サンプルの門分類比。

表 S2: 各サンプルの属分類比。

表 S3: 莱蕪豚とルーライ豚の糞便代謝物の完全なリスト。

表 S4: 莱蕪豚とルーライ豚の血液代謝物の完全なリスト。

表 S5: 莱蕪豚とルーライ豚の間の 81 種類の異なる血液代謝物。

表 S6: ゲノム全体のクリーンデータ情報。

表 S7: 上位 1% Fst の注釈付き遺伝子 811 個。

表 S8: FarmGTEx TWAS サーバーを使用して SNP から予測された脂肪組織の 2,930 個の遺伝子。

表 S9: 予測された遺伝子とトレポネーマの間の強い相関関係。

表 S10: GO および KEGG を使用した Fst および RNA の機能強化アノテーション。

表 S11: PRJNA747893 の NCBI SRA アクセッション列。

表 S12: PRJNA749115 の NCBI SRA アクセッション列。

サンプルの信頼性を確保し、サンプリングプロセス中の汚染を防ぐために、対象豚の排便直後に使い捨てPE手袋を使用して糞便サンプルを収集しました。次に、サンプルを特定の糞便サンプル保存チューブに移し、その固有のサンプル ID を DNA 抽出 ID およびシーケンス ID と照合しました。 DNA の品質は、NanoDrop 2000 分光光度計とアガロースゲル電気泳動を使用して確認されました。 NovaSeq を使用して高品質の DNA シーケンスを実行しました。 6000 シーケンス技術。メタゲノムシーケンシングおよび全ゲノムシークエンシングから得られた生データは、さらなる分析のための高品質のリードを取得するために品質管理の対象となりました。 16 サンプルの生のメタゲノム配列データの Q30 値は 91.65% ～ 95.8% の範囲でした。品質管理後の Q30 値は 91.67% ～ 95.78% の範囲でした。全ゲノム生データの場合、Q30 範囲は 88.55% ～ 90.45% でしたが、品質管理後のクリーンリードの Q30 範囲は 89% ～ 91% でした。メタゲノム遺伝子の存在量を制御するために、100 万あたりの転写産物 (TPM) 正規化が使用されました。正イオン検出モードと負イオン検出モードにおける QC サンプルの全イオン電流モード (TIC) が課され、比較されました。各クロマトグラフィーピークの応答強度と保持時間は一致しており、機器誤差が最小限であり、データ品質が信頼できることを示しています。

この研究におけるデータ処理と分析、および画像生成に必要なソフトウェアにはアクセスできます。ソフトウェアのバージョンは次のとおりです。

1. Trimmomatic (v0.39、http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic)

2.BWA(v0.7.17、http://bio-bwa.sourceforge.net)

3. メガヒット (http://i.cs.hku.hk/~alse/hkubrg/projects/idba_ud/)

4. MetaGeneMark (v3.25、http://exon.gatech.edu/meta_gmhmmp.cgi)

5. CD-HIT (http://www.bioinformatics.org/cd-hit/)

6. SOAPaligner (http://soap.genomics.org.cn/)

7. BLASTP (BLAST v2.2.28+、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)

8. MSDIAL (v4.7、http://prime.psc.riken.jp/compms/msdial/main.html)

9. SIMCA-P (v14.1)

10. Fastp (v0.20.0、http://opengene.org/fastp/fastp)

11.サムツール (v1.10)

12.パラレル(v0.7.1)

13. モスデプス (v0.2.9)

14.ピカードツール(v2.0.1)

15. Bcftools (v1.939)

16.GATK (v4.1.6)

17. Plink (v1.9、完全なフラグインデックス - PLINK 1.9 (cog-genomics.org))

18. 混和剤 (v 1.3.0)

19. VCFツール(v0.1.13)

20. FarmGTEx TWAS サーバー (http://twas.farmgtex.org/)

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リファレンスをダウンロードする

この研究は、中国国家重点研究開発プログラム (2021YFD1200802)、中国山東省重点研究開発プログラム (2021LZGC001)、中国国立自然科学財団 (認可番号: U21A20249、32272833)、および浙江省重点研究開発プログラムによって財政的に支援されました。中国（2021C02008）。

上海交通大学農生物学部動物科学科、上海、200240、中国

Xueshuang Lai、カマル・ラザ・カドリ、イーフェイ・ファン

浙江大学動物科学部動物科学科、杭州、310030、中国

Xueshuang Lai、Zhenyang Zhang、Zhe Zhang、Shengqiang Liu、Zitao Chen、Yifei Fang、Zhen Wang、Yuchun Pan、Qishan Wang

浙江大学海南研究所、三亜、310014、中国

Shengqiang Liu、Yuchun Pan、Qishan Wang

吉林大学動物科学部動物科学科、長竹、130015、中国

チュンヤン・バイ

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Yuchun Pan と Qishan Wang がこの研究を考案し、設計しました. Xueshuang Lai が原稿を書きました. Zitao Chen と Chunyan Bai がサンプルを収集しました. Xueshuang Lai と Zhenyang Zhang が DNA ライブラリを構築しました. データ分析を実行しました. Qishan Wang, Zhe Zhang, Qamar Raza Qadri と Yifei Fang が原稿を編集し、著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

Yuchun Pan または Qishan Wang への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Lai, X.、Zhang, Z.、Zhang, Z. 他。莱蕪豚とルーライ豚の統合されたマイクロバイオーム - メタボローム - ゲノム軸データ。 Sci Data 10、280 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41597-023-02191-2

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受信日: 2022 年 9 月 13 日

受理日: 2023 年 4 月 27 日

公開日: 2023 年 5 月 13 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41597-023-02191-2

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